Northern blot技術(shù)
經(jīng)乙二醛和二甲基亞砜變性處理后進(jìn)行的RNA電泳
這一方法原于McMaster和Carmichael(1977)。 含有乙二醛-DMSO的凝膠比含有甲醛的凝膠更難于進(jìn)行電泳, 因?yàn)榍罢哂緞?dòng)速率較慢而且需將電泳液時(shí)行循環(huán)以避免電泳過(guò)程中形成過(guò)高的H+梯度。盡管上述兩種凝膠具有近乎相等的分辨率(Miller,1987),但用含朋乙二醛-DMSO的凝膠對(duì)RNA進(jìn)行分級(jí)離,通常Northern雜交所顯示的RNA條帶更為銳利。
1)在滅菌的微理離心管內(nèi),混勻下列液體:
6mol/L乙二醛 5.4μl
DMSO 16.0μl
0.1mol/L磷酸(pH7.0) 3.0μl
RNA(多達(dá)10μl) 5.4μl市售乙二醛通常為40%溶液(6mol/L)。 由于接觸空氣的后乙二醛易于氧化,所以使用前需通過(guò)混合床樹(shù)脂(Bio-Rad AG 501-X8 對(duì)乙三醛溶液進(jìn)行去離子處理,直至溶液pH值大于5.0為止,然后可分裝在小份, 用蓋緊的小管貯存于-20℃。每小份乙二醛溶液只用1次,剩余液體應(yīng)予丟棄。0.1mol/L磷酸鈉(pH7. 0)的配法如下:將3.9ml 1mol/L磷酸二氫鈉、6.1ml 1mol/L磷酸氫二鈉和90ml 水混合,用DEPC處理上述溶液后高壓滅菌。每一泳道至多可分析10μg RNA,通常用10- 20 μg 細(xì)胞總RNA進(jìn)行Northern雜交,可以檢測(cè)高豐度mRNA(占mRNA總量的0.1%以上),如等測(cè)RNA含量極微,每個(gè)泳道應(yīng)加0.5-3.0μg poly(A)+RNA。
2)將微量離心管蓋嚴(yán),將RNA溶液置于%0℃溫育50℃溫育60分鐘后, 用冰水浴冷卻樣品,離心5秒鐘,使管內(nèi)所有液體沉降至管底。
3)于50℃溫育RNA溶液的同時(shí),灌制瓊脂糖水平凝膠,用1.4 %瓊脂糖分析1kb 以下的RNA樣品, 而用1%瓊脂糖分析1kb 以上的RNA樣品。 用0mmol/L 磷酸鈉(pH7. 0 )后, 降溫至70 ℃, 加入碘乙酸鈉固體至終濃度為10mmol/L(使RNA酶失活),再降溫至50℃,制膠,加入RNA樣品前一至少放置30分鐘使其凝固。用于RNA電泳的電泳槽需用去污劑溶液洗凈,用水沖洗,用乙醇干燥,然后灌滿3%H2O2,于室溫放置10分鐘后,用經(jīng)DEPC處理的水*沖洗電泳槽。因乙二醛可與溴化乙錠發(fā)生化學(xué)反應(yīng),所以制膠和電泳過(guò)程中誚避免作用溴化乙錠。
4)將RNA樣品冷卻至0℃,加入4μl 滅菌的并經(jīng)用DEPC處理的戊二醛-DMSO凝膠中樣緩沖液,隨后立即將上述樣品加至凝膠加樣孔。用已知大小的乙醛酰RNA作為分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物,如用18S和28S rRNA或或9S兔β-珠蛋白mRNA,上述RNA長(zhǎng)度分別為6322、2366和710個(gè)堿基。也可以從BRL購(gòu)置已知大小的RNA混合物作為分子量標(biāo)準(zhǔn)照物。通常分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物的泳道位于凝膠邊緣,便于電泳后將其切去進(jìn)行溴化乙錠染色,可能的話應(yīng)在分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物以及欲轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜或尼龍膜的樣品之間留空一個(gè)泳道。
乙二醛-DMSO凝膠加樣緩沖液
50%甘油
10mmol/L磷酸鈉(pH7.0)
0.25%溴酚藍(lán)
0.25%二甲苯青FF
5)將凝膠浸入10mmol/L磷酸鈉電泳液中,以3-4V/cm電壓降進(jìn)行電泳,同時(shí)按圖7.1對(duì)磷酸鈉容液時(shí)行持續(xù)再循環(huán),使溶液pH值維持在可被接受的限度 內(nèi)(pH>8.0時(shí)乙二醛將從PNA分子上解離)。另一方法為電泳時(shí)每30分鐘換一次磷酸鈉緩沖液。
6)電泳結(jié)束后(溴酚藍(lán)遷移出區(qū)8cm),切下分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物的凝膠條,浸入溴化憶錠溶液(0.5μg/ml,
用0.1mol/L乙酸銨配制)中染色30-45分鐘。在凝膠放置一透明遲,在紫外燈下照片上每個(gè)RNA條帶至加樣孔的距離,以RPN片段大小的lg對(duì)數(shù)值對(duì)RNA條帶的遷移距離作圖,用所得曲線計(jì)算從凝膠移到固相支持體后通過(guò)雜交檢出的RNA分子的大小。
7)RNA從凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜,將RNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜。
將變性RNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜
電泳完畢后,可立即將乙醛酰RNA自瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜,有以下幾種轉(zhuǎn)移方法:毛細(xì)管洗脫法、真空轉(zhuǎn)移法和電印跡法。毛細(xì)管洗脫法如下所述, 真空轉(zhuǎn)移法和印跡法則按有關(guān)儀器生產(chǎn)廠家產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。盡管有人認(rèn)為在轉(zhuǎn)移前對(duì)瓊脂糖凝膠進(jìn)行預(yù)處理實(shí)屬不必(Thomas,1980)甚至有害(Thomas,1983),
但我們認(rèn)為含甲醛的凝膠必須用經(jīng)DEPC處理的水淋洗數(shù)次,除去甲醛。 如果瓊脂糖中濃度大于1%或凝膠厚度大于0.5cm或待分析的RNA大于2.5kb,需用0.05mol/L氫氧化納浸泡凝膠20分鐘。 然后在凝膠上放置硝酸纖維素凝膜或尼龍膜,RNA隨向上遷移的緩沖液轉(zhuǎn)移至固相支持體(硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)上。
1)將凝膠移至一個(gè)玻璃皿內(nèi),用鋒利刀片修凝膠的無(wú)用部分,在凝膠左上角(加樣孔一端為上)切去一角,以作為下列操作過(guò)程中凝膠方位的標(biāo)記。
2)用長(zhǎng)和寬均大于凝膠的一塊Plexiglas有機(jī)玻璃或一疊玻璃板作為平臺(tái),將其放入大千烤皿內(nèi),上面放一張Whatman 3MM濾紙,倒入20xSSC使液面略低于平臺(tái)表面,當(dāng)平上方的3MM濾紙溫透后,用玻棒趕出所有的氣泡。
3)用一把新的解剖刀或切紙刀裁一張硝酸纖維素濾膜(Schleicher &Schuell BA85或與之相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品)。濾膜的長(zhǎng)度和寬度應(yīng)分別比凝膠大1mm, 接觸濾膜時(shí)須戴手套或用平頭鑷子(例如Millipore鑷子),用有油膩的手接觸過(guò)的硝酸纖維素濾膜不易浸溫。
4)將硝酸纖維素濾膜浮在去離子水表面,直至濾膜從下向上濕透為止,隨后用20xSSC浸泡濾膜至少5分鐘,用干凈的解剖刀片切去濾膜一角, 使其與凝膠的切角相對(duì)應(yīng)。不同批號(hào)的硝酸纖維膜,其浸濕速率相差懸殊。如濾膜池浮在水面上幾分鐘后仍未濕透,應(yīng)另?yè)Q一張新濾膜,因?yàn)槲淳鶆蚪竦臑V膜進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)移是靠不住的。這種濾膜也不必丟棄,可將其夾在用2xSSC浸濕的3MM濾紙中間, 高壓5分鐘。通常上述處理足以使硝酸纖維素濾膜濕透。高壓處理的濾膜應(yīng)夾在經(jīng)過(guò)高壓理理并用2xSSC浸濕的3MM濾紙中間,裝入塑料袋, 密封后于4℃保存?zhèn)溆谩?br />5)將凝膠翻轉(zhuǎn)后置于平臺(tái)上溫潤(rùn)的3MM濾紙中央,3MM濾紙和凝膠這間不能滯留氣泡。
6)用Saran包裝膜或Parafilm膜圍繞凝膠周邊,但不是覆蓋凝膠, 以此作為屏障,阻止液體自液池直接流至凝膠上方的紙巾層中。并非堆放得十分整齊的紙巾,易于從凝膠的邊緣垂下并與平臺(tái)接觸,這種液流的短路是導(dǎo)致凝膠中的RNA的轉(zhuǎn)移效率下降的主要原因。
7)在凝膠上方放置溫潤(rùn)的硝酸纖維素濾膜,并使兩者的切角相重疊。濾膜的一條邊緣應(yīng)剛好超過(guò)凝膠上部加樣孔一線的邊緣。濾膜置于凝膠表面適當(dāng)位置后,就不應(yīng)輕易移動(dòng),濾膜與凝交之間不應(yīng)留有氣泡。
8)用2xSSC溶液浸濕兩張與凝膠同樣大小的3MM濾紙, 溫潤(rùn)的放置在濕潤(rùn)的硝酸纖維濾膜上方。用玻璃棒趕出其間滯留的氣泡。
9)切一疊(5-8cm高)略小于3MM濾紙的紙巾,將其放置在3MM濾紙的上方。并在紙巾上方放一塊越境玻璃板,然后用-500g的重物壓實(shí)。其目的是建立液體自液池經(jīng)凝膠向硝酸纖維素濾膜的上行流路,以洗脫凝膠中的RNA并使其聚集在硝酸纖維素濾膜上。
10)使上述RNA轉(zhuǎn)移持續(xù)進(jìn)行6-18小時(shí),每當(dāng)紙巾浸濕后,應(yīng)換凝的紙巾。
11)轉(zhuǎn)移結(jié)束后,揭去凝膠上方的紙巾和3MM濾紙,翻轉(zhuǎn)凝膠和硝酸纖維素濾膜,以凝膠的一面在上,置于一張干的3MM濾約紙上,用一支極軟鉛筆或圓珠筆,在濾膜上標(biāo)記凝膠加樣孔的位置。
12)從硝酸纖維素濾膜上剝離凝膠棄之。以6x SSC溶液于室溫浸泡濾膜5分鐘,這一步可以除去粘著在濾膜上的瓊脂糖碎片。從6xSSC溶液中取出濾膜,將濾膜上的溶液滴盡后平放在一張紙巾上。于室溫晾干30分鐘以上。為估計(jì)RNA的轉(zhuǎn)移效率, 可將膠置于溴化乙錠溶液(0. 5 μg/ml , 以0.1mol/L乙酸銨配制)中染色45分鐘,于紫外燈下觀察。
13)將晾干的濾膜放在兩經(jīng)張3MM濾紙中間,用真空爐于80℃干烤0.5-2 小時(shí)。如干烤時(shí)間過(guò)長(zhǎng),濾膜極易脆裂并可能發(fā)黃。如果濾膜并不立即用于雜交實(shí)驗(yàn),可用鋁箔寬松地包裹起來(lái),在真空下貯存于室溫。
14)僅適用于濾膜上含有乙醛酰PNA的情況:雜交前需用20mmol/L Tris.Cl(pH8.0)于65℃洗膜,除去RNA上的乙二醛分子。
(三)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜前后進(jìn)行的RNA染色
當(dāng)RNA自瓊糖凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜之前,溴化乙錠的染色時(shí)間一般不宜過(guò)長(zhǎng),這是因?yàn)楸蝗玖巷柡偷暮怂岱肿樱滢D(zhuǎn)移效率有所降低。然而,用溴化乙錠作短暫染色,既不至于對(duì)核酸轉(zhuǎn)移過(guò)程產(chǎn)生可以察覺(jué)的掏作用,又*同時(shí)檢測(cè)凝膠和凝膜上的RNA的優(yōu)點(diǎn)。
1.方法I
1)電泳結(jié)束后,含乙二醛-DMSO的凝膠應(yīng)浸入含溴化乙錠(0.5 μg/ml)的10mmol/L磷酸鈉(pH7.0)溶液。甲醛凝膠需用無(wú)RNA酶的水淋洗,用20xSSC溶液浸泡,隨后用含溴化乙錠(0.5μg/ml)的20x
SSC溶液染色。
2)于室溫染色5-10分鐘,在紫外燈下觀察,照像。
3)按前所述方法, 將凝膠中的RNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜,轉(zhuǎn)移后能常在學(xué)光下也可看出已染色的RNA條帶。
這種方法僅適用于每一泳道均含有相當(dāng)大量(如5μg 以上)的RNA的情況。
2.方法Ⅱ
硝酸纖維素濾膜上的RNA也可以用下述方法染色:從干烤后的硝酸纖維素濾膜上剪下所需的條帶進(jìn)行染色,也可以用經(jīng)過(guò)雜交并經(jīng)X光片曝光后的整張濾膜進(jìn)行染色(A.Efstratiadis,未了表材料)。
1)將干燥的濾膜浸入5%冰乙酸中,于室溫浸泡15分鐘。
2)再將濾膜轉(zhuǎn)移至0.5mol/L乙酸鈉(pH5.2)、0.04%亞甲藍(lán)溶液中, 于室溫浸泡5-10分鐘。
3)用水淋洗濾膜5-10分鐘后,可見(jiàn)RNA分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物帶型銳利而poly(A)+mRNA為一模糊帶型,由許多長(zhǎng)度范圍從500堿基以下至5kb以上的各種mRNA共同組成,mRNA的平均長(zhǎng)度約為2kb。
雜交和放射自顯影
固定于濾膜上的RNA的預(yù)雜交、雜膠及淋洗等條件,與DNA雜交的相應(yīng)條件基本相同。現(xiàn)簡(jiǎn)述如下1)用下列兩種溶液之一進(jìn)行預(yù)雜交,時(shí)間1-2小時(shí)。若于42℃進(jìn)行,應(yīng)采用。
50%甲酰胺
5xSSPE
2xDenhardt試劑
0.1%SDS
若于68℃進(jìn)行,應(yīng)采用:
6xSSC
2xDenhardt試劑
0.1%SDS
2)在預(yù)雜交液中加入變性的放射性標(biāo)記探針,如欲檢測(cè)低豐度mRNA, 所用探針的量至少為0.1μg,其放射性比活度應(yīng)大于2x108計(jì)數(shù)/(分.μg)在適宜的溫度條件下繼續(xù)溫育16-24小時(shí)。切記RNA只與雙鏈DNA中一條單鏈互補(bǔ),因此如用單鏈探針, 則必須是能與RNA互補(bǔ)的一條單鏈。
3)用1xSSC、0.1%SDS于室溫洗漠20分鐘, 隨后用0.2xSSX、 0.1%SDS于68℃洗膜3次每次20分鐘。
4)用X光片(Kodak XAR-2或與之相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品)進(jìn)行放射自顯影, 附加增感屏于-17℃曝光24-48小時(shí)。