国产欧美日韩中文久久-国产欧美日韩在线一区二区不卡-国产欧美日韩在线人成aaaa-国产欧美日韩在线观看一区二区三区-婷婷国产天堂久久综合五月-婷婷99视频精品全部在线观看

電話咨詢:
010-50973130
技術文章
當前位置:首頁 > 技術文章 > 幾種常用轉化細胞的轉化

幾種常用轉化細胞的轉化

更新時間:2010-03-15  |  點擊率:2344
幾種常用轉化細胞和轉化技術



 

1)致癌化學物轉化細胞:轉化敘利亞地鼠胚胎細胞實驗
1.取材:妊娠后第13天取材,取數個同窩胚胎,去頭和內臟,在無菌條件下剪碎至米粒大小,再用0.25%胰蛋白酶(含0.01%EDTA)37℃消化30分鐘,濾過、低速離心、吸除消化液、加入營養液、制備成細胞懸液、接種入75cm/培養瓶中,接種密度10~20×106/75cm,37℃培養2~3天,在順利情況下能迅速長滿瓶面。
2.貯存:選大批生長狀態良好的細胞凍存,儲以備用。
3.致癌物處理:取凍存細胞,解凍,接種于25ml培養瓶中,每瓶含細胞10萬~30萬。待細胞生長進入指數增生期時,向培養瓶中加入致癌劑MNNG。致癌劑量1~3微克/毫升營養液。在37℃溫箱中培養12~48小時。
4.低血清培養:棄掉MNNG作用液,用溫PBS洗1~3次,加入含20%小牛血清,繼續置溫箱中培養2~3周,然后改用含5%血清培養液培養。低血清培養液不利于正常細胞生長,但已轉化的細胞仍能增殖和形成轉化灶。
5.轉化灶形成和分離:在成功情況下,用致癌物處理過的細胞于10天后在正常細胞之間,可產生數量不等的轉化灶。

2)病毒轉化細胞
1.血液制備:檸檬酸(Citric Acide)或肝素抗凝取血1~2ml,分裝入管中,每管0.5ml全血,置于4℃冰箱中30分鐘。
2.EBV病毒轉化:從液氮中取出凍存的0.5ml全血,在37℃水中迅速解凍。
3.將解凍細胞與10ml不含血清的RPMI 1640混合,2500 rpm離心2分鐘,棄上清,用含20%的胎牛血清、青、鏈霉素和慶大霉素的RPMI 1640生長培養基重懸細胞。
4.加入0.3~0.5ml的EBV病毒液,37℃水浴30分鐘~2小時,并不時搖動,以免出現凝塊。
5.分裝入50ml的培養瓶中,同時補加適量培養液,置入含5%CO2溫箱中,100%溫度下培養。
6.一周后加補入2ml培養基。
7.經常鏡檢培養物,每3~4天加液或換液,隨細胞數量增多,可分裝入大瓶中培養。

3)  癌基因轉化細胞:基因組DNA轉染法
1.提取基因DNA(含癌基因)。
2.DNA準備:取供體DNA50~100微克,加3M NaCl或醋酸鈉使終濃度至0.3M混勻。
3.再加2倍體積無水乙醇,3000轉/分離心10分鐘,去上清。
4.加入轉染緩沖液,待DNA充分融解后,再加入2.5M CaCl2,令終濃度為125mM,用吸管輕輕吹打三次。置室溫下10~30分鐘,待液體透明度降低,出現微濁藍色時,即可用于轉染受體細胞。
5.細胞:取生長狀態良好、處于半匯合階段的指數增生期細胞,在轉染前24小時,更換培養液1次。
6.轉染:向每瓶中加DNA-磷酸鈣沉淀物0.5~1ml/瓶,置37℃作用4~6小時。
7.培養:棄去培養液,用15%甘油處理3分鐘,無血清培養漂洗1次,加入新培養液,37℃溫箱培養24小時。
8.傳代:按1:5或1:10分瓶傳代,每2~3天換液1次,接近匯合時血清用量降至5%,培養2~3周。
9.檢測:逐日觀察,待出現轉化灶后,分離入另瓶中培養。
 




主站蜘蛛池模板: 亚洲欧美日韩天堂| 国产精品第5页| 亚洲欧洲日韩综合| 亚欧色| 国产全黄a一级毛片| 日韩精品在线免费观看| 亚洲区精品久久一区二区三区| 国产精品v欧美精品v日本精| 国产日产高清欧美一区二区三区 | 亚洲国产精久久久久久久| 国产精品观看| 黑人粗又大| 欧美一级网站| 成人a免费视频播放| 久久精品一级| 一级毛片视频播放| 欧美在线日韩在线| 日韩免费在线| www.亚洲一区| 亚洲欧美精品伊人久久| 国产精品天天看大片特色视频| 欧美日韩网| 亚洲欧洲综合| 日日久| 久久91精品国产一区二区| 午夜欧美性视频在线播放| 国产欧美色图| 国产精品成人久久久久久久| 六十路垂乳熟年交尾正在播放| 成人久久久精品乱码一区二区三区| 国产va在线视频观看| 日韩欧美视频在线播放| 国产日韩欧美亚洲综合在线| 国产视频最新| 国产免费高清视频在线观看不卡 | 亚洲国产精品欧美日韩一区二区| 欧美一区二区三区免费高| 久久福利一区二区| 欧美xxxbbb| 免费国产最新进精品视频| 日本a黄|